第3章第2节考点二基因工程第二步考点三基因工程第三步考点四基因工程第四步

同学们好！今天我们学习第3章第2节的考点二、考点三和考点四。
考点二：
第二步：基因表达载体的构建。
获取了足够量的 B t基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使 B t基因能够表达和发挥作用，这就需要构建基因表达载体。这一步是培育转基因抗虫棉的核心工作。
1、组成。一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的 DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA ，最终表达出人类需要的蛋白质。有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的 DNA 片段。
2、构建过程。在构建抗虫棉的基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的 DNA 片段；再利用 DNA 连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组 DNA 分子。
考点三：
第三步：将目的基因导入受体细胞。
构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。我国科学家采用他们独创的一种方法﹣﹣花粉管通道法，将 B t 基因导入了棉花细胞。花粉管通道法有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含目的基因的 DNA 溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将 DNA 溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。
1、转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2、农杆菌的特点。农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有 Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将 Ti 质粒上的 T - DNA （即可转移的 DNA ）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体 DNA 上。根据农杆菌的这种特点，如果将目
的基因插入 Ti 质粒的 T - DNA 中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
3、转化方法。根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。例如，可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
考点四：
第四步：目的基因的检测与鉴定。
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，这也是检查转基因抗虫棉是否培育成功的一步。
首先是分子水平的检测，包括通过 PCR 等技术检测棉花的染色体 DNA 上是否插入了 B t 基因或检测B t基因是否转录出了 mRNA ；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交，检测 B t 基因是否翻译成 B t 抗虫蛋白等。
其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定 Bt 基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
上述培育转基因抗虫棉的四个步骤，其实就反映了基因工程的基本操作程序。
在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因，并且由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的，将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。例如，将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射直接将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用钙离子处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
目前，基因工程已经步入产业化发展阶段，具有巨大的生产力和发展潜力，我们在充满信心和期待的同时，还要严格规范操作流程，科学、客观地评估风险，只有这样，才能让基因工程永葆生机。以上是考点二、考点三和考点四的内容。欢迎留言。