第3章第1节重组 DNA 技术的基本工具

同学们好！今天我们学习第3章第1节
重组 D N A 技术的基本工具。本节包括四个考点。
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA 双螺旋的直径只有2 纳米 ，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”呢？在培育转基因番木瓜时，首先要在体外对含有所需要基因的 DNA 分子进行“切割”、改造和“拼接”；然后，将重组 DNA 分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即准确切割 DNA 分子的“分子手术刀”、将 DNA 片段再连接起来的“分子缝合针”和将体外重组好的 DNA 分子导入受体细胞的“分子运输车”。科学家正是靠这三种必需的工具，才使培育转基因番木瓜这一奇妙构想变成了现实。
考点一：限制性内切核酸酶﹣“分子手术刀”。
切割 DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。
1、来源。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。原核生物容易受到自然界外源 DNA 的入侵，所以它在长期的进化过程中形成一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源 DNA 入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA ，使之失效，以保证自身的安全。迄今分离的限制酶有数千种，许多已经被商业化生产。
2、作用。能够识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如， EcoR1 、 Sma1限制酶的识别序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
3 、作用结果。DNA 分子经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两种形式﹣﹣黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将 DNA 分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
考点二：DNA 连接酶--“分子缝合针”。
1、作用。将切下来的 DNA 片段拼接成新的 DNA 分子，是靠 DNA 连接酶来完成的。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两个 DNA 片段连接起来的酶，称之为 DNA 连接酶。
2、种类。在基因工程操作中，常用的 DNA 连接酶主要有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为 E . coli DNA 连接酶；另一类是从T 4噬菌体中分离出来的，称为T 4 DNA 连接酶。这两类酶都能将双链 DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别。 E . coliDNA 连接酶只能将具有互补黏性末端的 DNA 片段连接起来，不能连接具有平末端的 DNA 片段。而T 4 DNA 连接酶既可以“缝合”双链 DNA 片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链 DNA 片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。
3、DNA 连接酶与 DNA 聚合酶是一回事吗？为什么？
不是一回事。虽然 DNA 连接酶和 DNA 聚合酶都是催化磷酸二酯键形成的酶，但两者存在显著的区别。
(1) DNA 聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而 DNA 连接酶是催化两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键，不是催化单个核苷酸与 DNA 片段之间形成磷酸二酯键。
(2) DNA 聚合酶以一条 DNA 链为模板，催化形成与模板链互补的 DNA 链；而 DNA 连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的 DNA 片段连接起来，它不需要模板。
此外，两者虽然都是蛋白质，但它们的组成和性质各不相同。
考点三：基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”。
怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核 DNA 之外，并具有自我复制能力的环状双链 DNA 分子。质粒 DNA 分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源 DNA 片段（即基因）插入其中。携带外源 DNA 片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体 DNA 上，随受体 DNA 同步复制。在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组 DNA 分子的筛选。
在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源 DNA 片段的大小上也有很大差别。这些基因工程载体，相当于一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。
考点四：DNA 的粗提取与鉴定。
DNA 、 RNA 、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如， DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离 DNA 与蛋白质。 DNA 在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同，它能溶于2 摩 / 升 的 氯化钠溶液。在一定温度下， DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定 DNA 的试剂。
方法步骤
1、称取约30克洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10毫升研磨液，充分研磨。
2．在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 转 / 分钟的转速下离心5 分钟 ，再取上清液放入烧杯中。
3、在上清液中加入体积相等的、预冷的体积分数为95%酒精溶液，静置2~3分钟，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的 DNA 。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在1万转/ 分钟 的转速下离心5 分钟 ，弃上清液，将管底的沉淀物（即粗提取的 DNA ）晾干。
4、取两支20毫升的试管，各加入2摩/升的 氯化钠 溶液5毫升。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的氯化钠溶液中。然后，向两支试管中各加入4毫升的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5分钟。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
结果分析与评价。
你能分析出粗提取的 DNA 中可能含有哪些杂质吗？
提取 DNA 时是将细胞碾碎从细胞中提取，因为细胞含有细胞膜，而细胞膜的主要组成成分为蛋白质和脂类，若操作不当，则会导致部分脂类和蛋白质残留。以上是本节内容。欢迎留言。