有没有大佬知道PCR 突然扩增不出产物是什么原因?

2023-03-25 08:12

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扩增不出产物那就根据PCR体系的组分和条件去思考分析。具体如下：

1）模板DNA：

是否被降解：DNA是不是溶解在1X TE（10 mM Tris-HCl，Hp8.0, 1 mM EDTA）里面的，因为核酸酶是金属离子依赖的，保存在1X TE里面既能通过EDTA的螯合作用保护DNA不被降解，又为DNA提供了一个缓冲环境。

所以基因组DNA或者质粒通常都是溶解保存在1X TE里的，溶解在水里会相对比较容易降解，而且没有缓冲环境的帮助，DNA长时间保存容易析出。

所以先跑个胶检查一下是不是模板被降解了，还有DNA每次从-20拿出来用的时候，要稍微离心一下或者轻弹管壁充分溶解再用，避免你吸的时候只吸到水。就像可乐结冰了重新溶解一样，会看到不均匀的现象。

DNA浓度：因为质粒扩增和基因组扩增用的模板量会有差别，质粒的DNA复杂度相对较低，而且单一，和基因组DNA相比，相同ng情况下有更高拷贝的目的基因，会更容易P出来。

而基因组DNA会比质粒要难P一点，不仅是因为序列复杂度还有拷贝数的问题，不同的人不同的提取方法，提出来的DNA质量参差不齐（会比质粒相对要更难提取一点，因为会结合很多组蛋白之类的其他物质），这也会影响扩增。

而PCR扩增对模板的量也是有一个比较合适范围的，你可以分别用师兄师姐给的确定能P出来的质粒和基因组DNA，按照他们的经验给的最适模板量，在最适模板量上下设置一个梯度范围去扩增，找到自己认为的最适模板浓度。注意质粒和基因组要求的模板量不同，基因组通常要更多的模板DNA

DNA的质量：根据A260/A280，判断一下你提的DNA质量，质量不好的就重新提一下吧，不要偷懒。

2）引物：

引物浓度：引物浓度尽量按照酶的说明书给的浓度，自己再那个浓度再设置一个范围去摸索一下。

引物设计是否合理：这个你可以设计好之后，让师兄师姐帮忙检查一下，避免设计的引物有问题，导致后面实验不断重复还找不到原因。

3）DNA聚合酶：我们实验室用的是KOD FX，这个酶很好用，扩增能力很强，保真性也挺高。酶要保存在-20，用的时候也要放在冰上，加完就尽快放回-20，这样对酶的保护是比较好的，避免因为保存不当，一管酶用到后面活性下降了，导致扩增不出来。

4）dNTP，酶反应的buffer：这个没什么好说的，根据说明书或者师兄师姐给的体系配就好了，通常不会出错，除非你忘记加了。

PCR体系的组分就以上那几样，剩下的就是用水补齐了，也没什么好说的。接下来是反应条件。