构建载体双酶切电泳后比目的片段pcr产物高

2022-10-27 20:41

pcr扩增出的片断正确但双酶切结果却偏大,不只是为什么?请高手指点? 我的酶切底物是构建好的质粒载体。原来还酶切的正确但自从转菌之后再提取质粒去酶切缺偏大。

1个回答

可能是质粒在转菌后部分碱基出现错配或者突变导致你酶切的位置发生变化.因为你pcr扩增只是你引物的位置只要不突变就可以正常扩增.建议你做个测序.

4个回答2022-11-28 12:12

我们用天根公司的胶回收试剂盒，回收目的基因及载体双酶切后的产物用于连接，连接体系如下：一般载体1微升，目的基因8微升左右（没.测OD）,用T4DNA连接酶（购于TaKaRa公司）1微升，再加酶缓冲液（...

1个回答2023-04-27 07:35

应为PCR扩增出来的是混合物,酶切回收后才基本是纯的目的片段. 载体一般不用PCR扩增,一般是质粒来源,也需要用切口一致的酶消化回收. 之后连起来就好了

1个回答2022-09-23 04:51

理论上讲PCR产物可以直接酶切连接反应。但是，以PCR产物酶切的时候没有办法证明双酶切是否成功、彻底（PCR产物会有ployA的存在必须切掉，但是PCR产物和酶切产物大小差别不大）。而以T载体为媒介...

2个回答2022-10-28 13:19

应该是PCR的杂带。这种情况的原因可能很多,比如引物设计的特异性不好,或者退火温度不合适等。应该是PCR的杂带。这种情况的原因可能很多,比如引物设计的特异性不好,或者退火温度不合适等。

2个回答2022-09-04 08:38

什么酶呢？最后酶切组的电泳条带是弥散，是只有质粒条带没有酶切产物条带，还是干脆就是空白？如果是弥散，最有可能的是所用的酶的反应条件要求比较严格，因为掌握不当而产生了星号活性，导致把质粒切碎了。建议...

2个回答2022-08-31 16:57

很显然是质粒发生了自连啦。切开的2个质粒连起来了，因此相当于2个质粒的大小。你需采用磷酸化避免自连发生。

2个回答2022-12-24 07:05

不可以，高保真酶产物一般都是平末端。纯化产物加taq酶，buffer和dNTP，72℃反应10~30分钟即可加尾，产物就可以直接与 T载体连接了。

2个回答2023-01-03 12:10

不需要酶切，直接以环形质粒为模板扩增PCR就可以。

1个回答2022-10-25 08:17

首先要问的是你的酶是快酶还是慢酶。如果是快酶，7个小时肯定长了，如果过是慢酶，你要看说明书有没有说切几小时后会出现新活性，也就是几小时后会去切其它位点。你这个情况，我个人猜测是出现新活性后单酶切导致的...

1个回答2023-01-10 21:50

重组质粒是把载体质粒酶切开，连接上PCR片段，然后转化感受态细胞，培养后提质粒获得的，这一系列过程中都无法检测目的基因是否连接成功了，是否转化成功了，只有对转化后的菌再次提质粒、酶切检测或PCR检测才...

热门问答

热门搜索更多