构建载体的时候，先用设计好的引物PCR所要的目的基因，再和T载体连接，再转化，再小抽，再双酶切，再和

2022-09-23 04:51

已经预先双酶切的目的载体连接，那么？先前的目的基因为什么不直接和目的载体相连呢？为什么还要经过T载体这一步呢？（所用引物未使用保护碱基），是什么原因呢？

1个回答

2022-09-23 09:39

理论上讲PCR产物可以直接酶切连接反应。
但是，以PCR产物酶切的时候没有办法证明双酶切是否成功、彻底（PCR产物会有ployA的存在必须切掉，但是PCR产物和酶切产物大小差别不大）。而以T载体为媒介，双酶切T载体，跑胶检测可以很清楚的看到酶切产物，并特异回收。

相关问答

构建载体双酶切电泳后比目的片段pcr产物高

1个回答2022-10-27 20:41

可能是质粒在转菌后部分碱基出现错配或者突变导致你酶切的位置发生变化.因为你pcr扩增只是你引物的位置只要不突变就可以正常扩增.建议你做个测序.

是否目的基因在PCR扩增时不用在引物中加入酶切位点，就可与pGEM-T载体连接？为什么？

1个回答2022-12-24 12:18

不用的，因为你PCR的时候加的 Tag酶，在扩增过程中它会在末端加上A... T vector就会与A结合了你可以在下一步步骤中，选择酶切位点去剪切后再与你的目的载体连接。

我想问一下从PCR开始有带胶回收双酶切，载体双酶切，胶回收后怎么把载体和酶切后的基因连在一起

4个回答2022-11-28 12:12

我们用天根公司的胶回收试剂盒，回收目的基因及载体双酶切后的产物用于连接，连接体系如下：一般载体1微升，目的基因8微升左右（没.测OD）,用T4DNA连接酶（购于TaKaRa公司）1微升，再加酶缓冲液（...

罗氏高保真的酶的PCR产物可以和T载体连接吗

2个回答2022-12-24 07:05

不可以，高保真酶产物一般都是平末端。纯化产物加taq酶，buffer和dNTP，72℃反应10~30分钟即可加尾，产物就可以直接与 T载体连接了。

为什么pcr产物要先连在t载体上

1个回答2023-05-17 02:57

T载体是一种克隆载体，链接后先得到较多的拷贝，可以提高链接表达载体的效率。

为什么pcr产物可以直接连t载体

1个回答2022-12-16 10:24

普通的taq聚合酶会在PCR反应过程中在3’末端加入一个碱基A，线性化平末端T载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基，从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提高了PCR产物连接和克隆的效率。

如何将目的基因与已经构建好的载体拼接？

4个回答2022-09-15 11:28

设计引物，引物两端带有设计好的酶切位点，找个有目的基因的细胞，提了ran，然后把目的片段p出来，然后跑胶，试剂盒回收目的片段。把载体和目的片段用同样的双酶切，再跑胶，回收切开的载体和目的片段，连接吧。

如何将目的基因与已经构建好的载体拼接？

2个回答2023-04-19 00:10

要构建重组载体的目的就是把目的基因连到载体上，所以最有效的重组dna是目的基因-载体。目的基因-目的基因和载体-载体都是失败的结果，这种结果的产生相对导致基因-载体的结果产生率下降。一般做重组载体选...

找公司合成目的基因后，下一步怎么连接过表达载体？直接酶切还是还要PCR扩增？

1个回答2023-04-21 00:10

那要看你用什么方式构载体。如果用酶切连接的方式，可以直接酶切。如果用同源重组，应该是要PCR的

PCR产物与T载体连不上求助

1个回答2023-04-14 05:02

前一段时间我也是，不知道为毛，T-A克隆就是不成功。。。以前的以前轻松的事情，前段时间就是塞不进去。后来，我试了平末端克隆，反而长菌了。。菌落数比较少，但是阳性率还行。由于平末端克隆试剂盒一般小贵，...

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